多聚酶链式反应扩增DNA片段

师哈哈达人

教学目标：
（一）知识与技能
1、了解pcr技术的基本操作
2、理解pcr的原理
3、讨论pcr的应用
（二）过程与方法
在多聚酶链式反应扩增dna片段的实验过程中，应避免外源dna污染，严格控制温度等反应条件
（三）情感、态度与价值观
通过对pcr实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
教学重点：pcr的原理和pcr的基本操作
教学难点：pcr的原理
教学过程：
（一）引入新课
在现代生物技术中，dna技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对dna分子碱基序列的分析。而分析dna碱基序列，就需要一定量的dna片段。怎样迅速获得足够量的dna片段呢？今天我们来研究学习dna分子的扩增技术――pcr技术。
（二）进行新课
1．基础知识
pcr技术扩增dna的过程，与细胞内dna复制过程类似：
1．1细胞内dna复制条件分析：
条件 组分 作用
模板 dna的两条单链 提供复制的模板
原料 四种脱氧核苷酸 合成dna子链的原料
酶 解旋酶
dna聚合酶 打开dna双螺旋
催化合成dna子链
能量 atp 为解螺旋和合成子链供能
引物 rna 为dna聚合酶提供合成的3’端起点
1．2细胞内dna复制过程
（1）dna的反向平行结构：（结合投影图）
核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。
dna双螺旋结构的反向平行结构：
（2）dna的复制过程:
解    旋：解旋酶、atp，dna两条链打开，，形成两条dna单链。
引物结合：在dna单链3’端与dna反向配对结合，确保引物3’端与dna单链准确配对。
dna聚合酶结合：
子链合成：dna聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工：dna聚合酶i将引物切去，并合成空缺处的dna单链，再由dna连接酶将不连续的dna子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）
子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘：dna聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。rna聚合酶没有校对功能，因此rna的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在rna引物完成功能后即被dna聚合酶i删去，代之以高保真的dna链。
［思考］dna分子能准确复制的原因有哪些？
dna双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；dna聚合酶的复查功能。
［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？rna合成、蛋白质合成。
1．3dna分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，dna双螺旋打开，形成两条dna单链，称为变性。
恢复螺旋：在50℃左右时，两条dna单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液,dna模板,四种脱氧核苷酸,热稳定dna聚合酶,两种引物。
反应场所：pcr仪（自动温度周期性调节）。
［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）1．4pcr的反应过程
变性：在95℃时dna解旋
复性：在50℃时引物与dna单链结合
延伸：在72℃时合成dna子链（两个引物间的序列）2．实验操作
2．1 pcr反应体系：缓冲液、dna模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定dna聚合酶、两种rna引物，水共2页，当前第1页12

多聚酶链式反应扩增DNA片段
2．2 实验操作步骤
2．3 按照pcr反应体系配方配制反应液；
（2）将pcr反应体系50μl用微量移液器转移到微量离心管（0.5ml）中；
（3）将微量离心管放到pcr仪中；
（4）设置pcr仪的工作参数。
（5）dna在pcr仪中大量扩增。
2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
3．实验注意事项
3．1避免外源dna污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。
3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。
3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。
4．结果分析与评价
4．1反应液稀释：取2μlpcr反应液，添加98μl蒸馏水；2．分光光度计调零：将100μl蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。
4．2将100μl反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。
4．3计算：dna含量＝50×光吸收值×稀释倍数
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1 在（    ）的温度范围内，dna的双螺旋结构解开
a. 10－20℃       b. 80－100℃         c. 20－30℃        d. 40－60℃
解析：蛋白质大多不能忍受60－80℃的高温，而dna在80℃以上才会变性。
答案：b
例2 关于dna的复制，下列叙述正确的是（    ）
a.dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从5’端延伸dna链
b.dna复制不需要引物
c.引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合
d.dna的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸
解析：由于dna聚合酶不能从头开始合成dna，只能从引物的3’端即复制方向由3’端向5’端延伸；由于dna分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在dna聚合酶作用下合成的，其合成方向是从子链5’端向3’端延伸。
答案：c
综合应用
例3 下列有关pcr描述，不正确的是（    ）
a.是一种酶促反应
b.引物决定了扩增的特异性
c.扩增产量按y＝（1＋x）n
d.扩增对象是氨基酸序列
e.扩增对象是dna序列
解析：pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术，它以极少量的dna为模板，以四种脱氧核苷酸为原理，在引物的作用下使dna聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的dna拷贝，其扩增产量为y＝（1＋x）n，y代表dna片段扩增后的拷贝数，x表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数，因此答案选d。
答案：d
课后探究
1、pcr与生物体dna复制有何区别？
2、如果在案件侦破过程中，只收集到一根毛发，但它所含的遗传信息太少，该怎么办呢？
★教后小记
教师在教学过程中，可以先引导学生回忆必修2的有关dna复制的知识，在此基础上，学生可加深对于pcr原理的认识。对于pcr反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与pcr的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
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