查看: 10|回复: 0

手把手教你工具病毒的注射方法(上)

[复制链接]

26万

主题

26万

帖子

80万

积分

论坛元老

Rank: 8Rank: 8

积分
808224
发表于 3 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式
 

 

在工具病毒使用的过程中使用方法的选择尤为重要,尤其是体内感染时,注射方法的选择在一定程度上也决定了病毒的使用效果。本文中将对神经系统病毒感染常用注射方法予以详细的介绍,并对不同注射方法的适用特性总结比较,供大家在注射方法选择及操作时参考。

脑立体定位注射



脑立体定位注射是神经系统病毒感染最常用注射方法,其具体操作步骤如下:
1. 实验前准备
a.麻醉:小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥(剂量为80mg/100g体重),放置于饲养笼内,约5~10 min;
b.待小鼠完全麻醉后,用剃毛器将小鼠头部毛发剃除干净。
2. 固定小鼠
a.将麻醉剃毛后的小鼠置于脑立体定位仪上,先将小鼠门齿卡在适配器门齿夹上,轻轻压上门齿夹横杆,调整适配器高度和前后位置,使耳杆可以方便进入外耳道;
b. 左手托起小鼠头部,将左侧耳杆插入小鼠耳道并固定,接着将右侧耳杆也插入小鼠耳道,调节左右两侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置,先锁紧固定一侧耳杆,后旋紧另一侧耳杆,使动物头部不能晃动,同时旋紧门齿夹螺丝;
c. 固定效果检查:鼻对正中,头部不动,提尾不掉,目测头顶位置水平。
3. 暴露头骨及水平校准
a.依次用碘伏和75%酒精对头顶皮肤进行消毒,之后用眼科剪沿中间位置剪开头部皮肤(长约0.8 cm);
b.去除颅骨表面的结缔组织并用双氧水擦拭,暴露出前囟、后囟(图);
c.调整前囟和后囟在同一水平位置,并调整左右两侧平行,将微量注射器针头置于前囟点位置后坐标归零。

4. 病毒注射
a.根据注射脑区位置的横纵坐标找到颅骨表面下针点并标记,移开注射针,小心地用颅骨钻轻磨颅骨,将颅骨打薄至出现裂缝,用1ml医用注射器针头小心挑开颅骨,一定要防止扎到脑组织(如果此过程出血,可用小的医用棉球拉成长条形将血吸走);
b.用PBS冲洗微量注射器3~5次(每次吸取5 μl);
c.吸取病毒:先吸取1μl空气,再吸取1 μl病毒(在空气中测试一下注射器是否通畅);
d.将微量注射器固定在脑立体定位仪上,并与微量注射泵相联,将微量注射器针头经颅骨钻孔处垂直插入脑内目标位置,启动微量注射泵开始注射(注射速度为0.2ul/min),注射完成后,留针5~8 min,缓慢抽出注射器针头。
5. 动物复苏
a.用医用缝合线缝合皮肤,再用碘伏对创口及其附近进行消毒;
b.将小鼠从脑立体定位仪上取下,放置于饲养笼内(可在旁边放置电暖器),待其苏醒。

脊髓注射



脊髓注射是脊髓神经节段感染常用的注射方法,其具体操作步骤如下:
1. 实验前准备
a.麻醉:小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥(剂量为80mg/100g体重),放置于饲养笼内,约5~10 min;
b.待小鼠完全麻醉后,剔除小鼠背部毛发,眼部涂抹金霉素软膏以保持湿润。
2. 脊髓暴露及固定
a.依次使用碘伏和75%酒精对背部皮肤消毒,用一次性手术刀片划开其背部(约在小鼠俯卧时背部隆起最高处)皮肤,尽量去除背部肌肉,暴露其椎骨;
b.使用耳杆将小鼠脊椎固定在立体定位仪上,确保稳定,用游丝镊去除覆盖在椎间隙上的肌肉和硬脊膜,可见白色的脊髓。
3. 病毒注射
a.清洗注射器:用PBS冲洗微量注射器3~5次(每次吸取5 μl);
b.吸取病毒:先吸取0.5μl空气,再吸取适量病毒(约0.5ul);
c.将微量注射器固定在立体定位仪上并移至脊髓表面,待其刚好接触脊髓表面时,以45°倾斜插入脊髓内,针头进入距离430μm(相当于垂直深度300μm),留针2min后开始注射(注射速度200nl/min),注射一半体积的病毒后,停止注射并留针2min;
d.退针至Z轴深度210μm(相当于垂直深度150μm)处,留针2min,将剩余病毒注射完毕,留针3min后将针头完全退出。
4. 动物复苏
a.将小鼠从立体定位仪上取下,对创口消毒后,将背部皮肤缝合并再次消毒;
b.将小鼠放回饲养笼(可在旁边放置电暖器),待其苏醒。

鞘内注射



当感染整个脊髓时,脊髓定点注射的方法便不再适用,这时就需要用鞘内注射,其具体操作步骤如下:
1. 实验前准备
a. 麻醉:将小鼠用异氟烷快速麻醉后,放置于操作台面上,将其口鼻置于连同麻醉系统的软管内,持续给异氟烷使其保持麻醉状态,并在小鼠眼部涂抹金霉素眼膏保护眼睛;
b.在小鼠的脊柱注射目标位置下方放置一15ml离心管,使其拱起,用剃毛器将拱起部位毛发剃去。
2. 病毒注射
a.依次用碘伏、酒精对剃毛处皮肤进行消毒;
b.用25ul微量注射器吸取适量病毒,用手触摸找到要注射的脊髓节段,对着两个棘突中间位置扎针,当小鼠尾部轻微上翘时表示成功插入髓鞘,此时固定针头,缓慢注入适量病毒(一般5~10ul);
c.病毒注射完稍等片刻,拔出针头,用酒精棉球擦拭皮肤。
3. 动物复苏
关闭气体麻醉系统,将小鼠放回饲养笼内(可在旁边放置电暖器),待其苏醒。

眼部注射
(玻璃体注射)



感染眼部神经细胞时,常用眼部原位注射,其具体操作步骤如下:
1. 实验前准备
a.麻醉:小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥(剂量为80mg/100g体重),放置于饲养笼内,约5~10 min;
b.小鼠麻醉后,在其眼部涂抹红霉素眼膏以保持眼部湿润。
2. 病毒注射
a.用微量注射器吸取适量病毒备用;
b.取完全麻醉的小鼠置于台面上,并给予单一冷光源照射,左手按住头部,稍用力使其眼球部分突出,右手持微量注射器自角膜后缘1mm位置插入玻璃体腔内,针尖先垂直进入,随后倾斜,慢慢推注病毒(一般每只眼1~3ul);
c.病毒注射完毕,慢慢抽出针头。
3. 动物复苏
将小鼠放回饲养笼内(可在旁边放置电暖器),待其苏醒。

尾静脉注射



当感染全身神经系统时常用尾静脉注射,其具体操作步骤如下:
1. 小鼠固定
a.首先提取小鼠尾巴,将其放在鼠笼盖或手臂上,并进行适当安抚;
b.然后将小鼠装入固定器(可用50ml离心管改造)中,盖紧盖子,并使其尾巴朝外露出;
c.用酒精棉球擦拭小鼠尾巴,使其血管扩张(也可用热水、加热器等)。
2. 病毒注射
a.用生理盐水或PBS将病毒稀释至合适滴度(控制病毒注射体积在100-200 μl);
b.用1ml注射器吸取100~200 μl病毒;
c.将小鼠尾巴拉直使其红色静脉清晰可见,在距尾尖1/3处进针,缓慢注入病毒后拔出,用棉球按压注射点1min左右以止血。
3. 动物恢复
将小鼠从固定器上取下,放回原饲养笼中。

注意事项

1. 脑立体定位注射位点精确性要求高,坐标需精确,在正式病毒注射实验前可注射蓝墨水等染料确认注射坐标是否正确;
2. 调平的质量保证了脑区注射点的准确性,确保在开始注射前调整前囟和后囟点位于同一水平面,两点连线左右相同距离的点也处在同一水平面;
3. 操作过程中动作要轻柔,不要盲目用力或暴力操作,避免造成脑损伤、注射器针头折弯等影响实验;
4. 脊髓感染一般每节两个位点即可,若发现感染范围不够可适当增多注射点;
5. 鞘内注射时,异氟烷麻醉起效快苏醒快,但要控制好浓度,过量容易致使小鼠死亡;
6. 鞘内注射时注意控制病毒注射体积,避免鞘内压力增加而造成损伤;
7. 眼部注射时对注射病毒的眼睛做好局部抗菌处理,且下针时注意避开血管;
8. 尾静脉注射在相同剂量的情况下建议注射体积尽量大些,一般每只小鼠注射200ul左右。
最后,对以上注射方法特性总结如下表:
[tr][td]注射方法
[/td][td]适用情况
[/td][td]优 势
[/td][td]不 足
[/td][/tr][tr][td]脑立体定位注射
[/td][td]全脑或部分脑区感染
[/td][td]摆脱血脑屏障,感染位点特异,病毒用量少
[/td][td]操作复杂且难度大,对动物损伤较大,感染范围有限
[/td][/tr][tr][td]脊髓注射
[/td][td]脊髓特定节段感染
[/td][td]感染位点特异,病毒用量少
[/td][td]操作复杂且难度大,对动物损伤较大,感染范围有限
[/td][/tr][tr][td]鞘内注射
[/td][td]脊髓全部
[/td][td]可感染整个脊髓甚至脑部,对动物损伤小
[/td][td]病毒用量大,不能实现位点特异性感染
[/td][/tr][tr][td]眼部注射
[/td][td]视网膜等
[/td][td]眼部特异性好,病毒用量少,损伤小
[/td][td]应用较局限,仅适用于眼部感染
[/td][/tr][tr][td]尾静脉注射
[/td][td]中枢神经系统
[/td][td]操作简单,感染范围广,对动物无损伤
[/td][td]病毒用量大,无区域特异性,仅PHP.eB、PHP.B、9等跨血脑屏障血清型的AAV适用
[/td][/tr]
回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

QQ| Archiver|手机版|小黑屋| 师哈哈 |网站地图

Copyright © 2019-2025 Www.biiyy.Com.   All Rights Reserved.

Powered by Discuz! X3.4( 苏ICP备14049462-3号 )